Biogenese chloroplastidärer Proteinkomplexe am Beispiel der Gerste mit Hilfe der 2-D-Gelelektrophorese

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung
1.2 Chloroplastidäre Proteinkomplexe
1.3 Grundlagen zur Analyse chloroplastidärer Proteinkomplexe
1.4 Zielsetzung

2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Chemikalien
2.1.2 relevante Geräte
2.1.3 Versuchsorganismus
2.2 Methoden
2.2.1 Pflanzenanzucht
2.2.2 Belichtung
2.2.3 Chloroplasten- bzw. Etioplastenisolierung
2.2.4 Mitochondrienisolierung
2.2.5 BN-PAGE
2.2.6 Tricin-SDS-PAGE als zweite Geldimension für BN-Gele
2.2.7 Coomassie-colloidal Färbung von Proteingelen:
2.2.8 Auswertung und Identifizierung

3 Ergebnisse
3.1 Präparation von Organellen aus ergrünender Gerste
3.2 Zweidimensionale Auftrennung plastidärer Proteinkomplexe mittels BN-/ Tricin-SDS-PAGE
3.3 Identifikation der Proteinkomplexe und deren Untereinheiten
3.4 Kinetik beim Auf- und Abbau von Proteinkomplexen bei der Transformation von Etioplasten in Chloroplasten

4 Diskussion
4.1 Plastidenisolierung
4.2 Proteinfärbung mit Coomassie Blue
4.3 Vergleich der Ergebnisse mit der Literatur
4.3.1 Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen
4.3.2 Fazit
4.4 Vorteile der BN-PAGE gegenüber vergleichbarer Technik

5 Zusammenfassung

6 Literatur

7 Anhang
7.1 Abkürzungen
7.2 Glossar

1 Einleitung

Pflanzliche Organismen sind aus einer großen Zahl der verschiedensten organischen Verbindungen aufgebaut. Sie sind in der Lage, den für die Synthese dieser Verbindungen benötigten Kohlenstoff durch Fixierung von Kohlendioxid zu gewinnen. Die Energie hierzu beziehen sie aus der elektromagnetischen Strahlung der Sonne im Bereich von etwa 400nm - 700nm. Der entsprechende Prozess wird als Photosynthese bezeichnet, welche bei eukaryotischen Zellen in den Chloroplasten stattfindet. Die pflanzlichen Organismen sind zur Produktion organischer Substanzen aus rein anorganischen Bausteinen befähigt. Die gesamte auf der Erde vorhandene organische Substanz wird durch diesen Prozess gebildet.

Chloroplasten als Photosyntheseorganellen

Die Chloroplasten sind membranreiche Organellen in Zellen von Algen, Moosen, Farnen und höheren Pflanzen. Sie können in Form und Größe variieren, erscheinen aber typischerweise als 4 bis 10µm lange Ellipsoide mit einer Dicke von etwa 1 µm, von denen es pro Zelle zwischen 1-1000 gibt. Abbildung 1 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines Gersten-Chloroplasten.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Dünnschnitt durch einen Chloroplasten der Gerste. Die Form und Anordnung der Grana ist für normal ausgebildete Chloroplasten typisch. Die dunklen Kreise im Bild sind sog. Plastoglobuli. Grana (Thylakoidstapel) können bis zu 25 Thylakoide enthalten [35].

Chloroplasten haben eine äußere Membran, welche durch den Intermembranraum von der inneren Membran getrennt ist. Beide Membranen zusammen werden als Envelope bezeichnet. Die innere Membran umschließt das Stroma, eine konzentrierte Lösung von Enzymen, die zudem DNA, RNA sowie Ribosomen enthält. Letztere sind an der Synthese verschiedener Chloroplastenproteine beteiligt. Das Stroma umgibt seinerseits ein drittes Kompartiment, das Thylakoid. Thylakoide entstehen durch Einstülpungen und anschließende Abschnürungen der inneren Membran und werden in Grana- und Stromathylakoide (gestapelte und nicht gestapelte Bereiche) eingeteilt. Ein Chloroplast enthält etwa 10-100 Granastapel. Diese bestehen aus Lipiden und Proteinen, wobei der Proteinanteil über 50% liegt [23]. Die Proteinkomplexe liegen der Membran auf oder sind in sie eingebettet. Chlorophyll und andere Photosynthesepigmente sind locker an Proteinkomplexe gebunden.

Neben der Thylakoidmembran können sich noch Plastoglobuli und Stärkekörner im Stroma befinden. Die beiden Envelope-Membranen haben einen Abstand von ca. 3nm zueinander. Die äußere Membran ist relativ durchlässig und besteht aus einer Doppellage von Phospholipid- Molekülen und Glycolipiden, in die an manchen Stellen auch Proteine eingebaut sind. Der Anteil der Proteine ist jedoch viel niedriger und der molekulare Aufbau viel einfacher als bei der inneren Membran. Diese ist die eigentliche selektive Barriere, die darüber entscheidet, welche Stoffe in die Chloroplasten aufgenommen werden und welche diese verlassen können. In der Pflanze kommen mehrere Arten von Plastiden vor, welche aus den Proplastiden hervorgehen. In Geweben, welche der Photosynthese dienen sollen, werden sie unter Lichteinfluss zu Chloroplasten. In Abbildung 2 ist diese Entwicklung dargestellt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2: Entwicklung eines Proplastiden in einen Etio- bzw. Chloroplasten [21], verändert.

Lässt man Keimlinge im Dunkeln wachsen, so bilden sich stattdessen Etioplasten, welche eine andere Struktur als die Chloroplasten aufweisen. An Stelle der Thylakoide entsteht ein gitterartiger Prolamellarkörper, welcher hauptsächlich aus einem protochlorophyllidhaltigen Proteinkomplex besteht. Die zahlreichen Plastoglobuli dienen als Lipidspeicher [21]. Bei Belichtung werden aus den Plastoglobuli und dem Prolamellarkörper die photochemisch aktiven Thylakoide aufgebaut und Protochlorophyllid, bzw. Protochlorophyll wird in Chlorophyll umgewandelt. Innerhalb weniger Minuten nach Beginn der Belichtung setzt begrenzt die Photosyntheseaktivität ein [20]. Für die vollständige Transformation werden allerdings einige Stunden benötigt.

Abbildung 3 zeigt elektronenmikroskopische Aufnahmen der Transformation.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3:

a. Prolamellarkörper im Etioplasten
b. Röhrentransformation: Prolamellarkörper nach einer Minute Belichtung
c. Dispersion des Prolamellarkörpers in primäre Lamellenschichten. Eine Minute Belichtung nach 15 Minuten Dunkelheit
d. Granabildung: nach 24 Stunden kontinuierlicher Belichtung
e. Granum eines ausdiffernezierten Chloroplasten [35]

In der Thylakoidmembran laufen die photochemischen Reaktionen der Photosynthese, die zur Spaltung von Wasser, zur Bildung von ATP und zur Reduktion von NADP+ führen, ab. Dazu sind 4 große Proteinkomplexe in der Membran vorhanden: die beiden Photosysteme, die ATP-Synthase und der b6f-Komplex, welcher den Elektronentransport zwischen den beiden Photosystemen vermittelt. Sie sind zusammen aus 75 - 100 Proteinen aufgebaut, wodurch die Komplexe besser reguliert werden können. Es sind eine Vielzahl von Proteinen an dem Prozess der Biogenese und der Regulation der 4 großen Komplexe beteiligt, welche die Biosynthese und den Zusammenbau von Cofaktoren, Einfügen von Proteinen in die Membran, Faltung und Abbau von Proteinen steuern. Viele dieser Proteine liegen in der Thylakoidmembran. Um die Biogenese und die verschiedenen Thylakoidfunktionen zu steuern sind Kinasen, Phosphatasen und andere Signaltransduktoren vorhanden. Insgesamt enthält ein Chloroplast 2000 - 5000 verschiedene Proteine [28]. Die Bildung der einzelnen Proteine, der Zusammenbau dieser zu den Komplexen und die präzise Platzierung müssen genau aufeinander abgestimmt sein, da sonst durch freie Elektronen irreparable Schäden entstehen können.

Der einleitende Schritt der Photosynthese besteht darin, dass Lichtquanten durch Empfängermoleküle (Pigmente) absorbiert werden und ihre Energie zu einem photochemischen Reaktionszentrum weitergeleitet wird. Anschließend wird die Energie der Lichtquanten in ATP und NADPH + H+ umgewandelt. An diese photochemische Reaktion ist der rein biochemische Prozess der CO2-Reduktion im Stroma der Chloroplasten durch seinen Bedarf an ATP und NADPH + H+ eng gekoppelt. Durch Fixierung von Luft-CO2 und seine Reduktion zu Kohlenhydraten werden die Endprodukte der Photosynthese gebildet, welche die stabile chemische Energie beinhalten. Neben der Photosynthese sind die Chloroplasten an noch weiteren Funktionen, wie der Stärkesynthese, der Lipidsynthese und der Nitrat-Assimilation beteiligt. [7]

1.2 Chloroplastidäre Proteinkomplexe

An der Photosynthese sind viele Proteine, Pigmente und andere Moleküle beteiligt, und viele von ihnen sind ein Teil von größeren Proteinkomplexen. Der Vorteil von Proteinkomplexen im Vergleich zu einzelnen Proteinen ist die bessere Regulation. Zu ihnen gehören z.B. die beiden Photosysteme, die Light-Harvesting-Komplexe (LHC), der b6f-Komplex, die RubisCO und die ATP-Synthase.

Das Photosystem I (PS I) ist ein Pigmentproteinkomplex, der eines der photosynthetischen Reaktionszentren bindet und die Oxidation von Plastocyanin an der Lumenseite und die Reduktion von Ferredoxin an der Stromaseite der Thylakoidmembran katalysiert. Es ist den Arbeitsgruppen Saenger und Witt (1993) gemeinsam gelungen, mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse die dreidimensionale Struktur des PS I aus dem thermophilen Cyanobakterium Synechococcus elongatus zu ermitteln [16]. Es zeigt eine Trimerstruktur. Von den bisher identifizierten 12 verschiedenen identifizierten Untereinheiten, konnten bislang nur 6 eine Funktion zugeordnet werden. Das Zentrum ist besteht aus den Untereinheiten PsaA und PsaB. Sie binden die Chromophore Chla, Redoxträger und etwa 100 Chla-Antennenpigmente. Der Untereinheit PsaC werden die Fe-S-Zentren F A und F B zugeschrieben, die Untereinheit PsaF wird als Bindungsstelle für Plastocyanin diskutiert. PsaL ist an der Trimerisierung des Komplexes beteiligt und PsaE ist in den zyklischen Elektronentransport der Photosynthese involviert. Das PS I höherer Pflanzen liegt assoziiert mit einem Multipigmentproteinkomplex vor, der als LHC I bezeichnet wird. Dieser enthält 20% des gesamten Chlorophylls, welches in der Thylakoidmembran enthalten ist. Bei der Isolation des LHC I liegt dieser als Oligomer vor, doch in vivo liegt wahrscheinlich wieder ein trimerer Komplex vor.

Das Photosystem II (PS II) ist ebenfalls ein Pigmentproteinkomplex, der das zweite photosynthetische Reaktionszentrum bildet. Es vermittelt den Elektronentransfer von Wasser zum Plastochinon und spaltet Wasser unter Freisetzung von Sauerstoff. PS II ist aus mindestens 16 verschiedenen Untereinheiten zusammengesetzt und von vielen ist die genaue Funktion noch nicht bekannt. Das Zentrum ist wiederum ein Heterodimer aus den Untereinheiten D1 und D2. An diesem Heterodimer sind 4 - 5 Chla, 2 Phaeophytine, 2 Plastochinone und 1 - 2 Carotinoide gebunden. Die beiden Untereinheiten CP 43 und CP 47 binden jeweils etwa 15 Chlorophyllmoleküle. Eine weitere Untereinheit, Cytochrom b559 (Cyt-b559), besitzt möglicherweise eine Schutzfunktion gegen Lichtschädigung. Das PS II liegt assoziiert mit dem LHC II vor, welcher die Photonen des Lichts absorbiert und zum Reaktionszentrum transportiert. Bisher konnten 5 verschiedene LHC II Pigmentproteinkomplexe charakterisiert werden. Der größte Komplex ist der LHC IIb, welcher 42% des gesamten Chlorophylls der Thylakoidmembran bindet. Er liegt als Trimer vor und enthält 3 verschiedene Polypeptide. LHC IIa, LHC IIc, LHC IId und LHC IIe enthalten zusammen mehr als 3% des Chlorophylls.

Zwischen den beiden Photosystemen steht in der Elektronentransportkette der b6f-Komplex, welcher auch den Protonentransport über die Thylakoidmembran bewirkt und damit zum Aufbau des Protonengradienten beiträgt. Der Komplex hat einen asymmetrischen Aufbau, liegt als Dimer vor und besteht aus 4 größeren Polypeptiden, Cyt-b6, welches 2 Moleküle Häm b enthält, Cyt-f6, das Rieske-Protein, ein Eisen-Schwefel-Protein, und die Untereinheit IV. Daneben sind noch 3 kleinere hydrophobe Polypeptide bekannt, die als Pet M, Pet G und Pet L bezeichnet werden [11, 12].

Die RubisCO ist ein sehr häufig vorkommendes Protein und macht bis zu 50% des löslichen Proteins in grünen Blättern aus. Sie ist im Stroma lokalisiert und katalysiert die Fixierung von CO2. Die RubisCO besteht aus 8 großen und 8 kleinen Untereinheiten. Beim Zusammenbau des Komplexes im Stroma ist ein Chaperon beteiligt.

Die ATP-Synthase setzt den Protonengradienten über der Thylakoidmembran zur Synthese von ATP aus ADP und organischem Phosphat ein und ist damit ein Schlüsselenzym des Energiemetabolismus der Zelle. Es besteht aus einem löslichen F1-Teil, der die Synthese von ATP katalysiert und einem membrangebundenen F0-Teil, welcher für den Fluss der Protonen verantwortlich ist. Der F1-Teil ist auf der Stromaseite lokalisiert und besteht aus 5 Untereinheiten, welche als α-, β-, γ-, δ- und ε-Untereinheiten bezeichnet werden. Der F0-Teil besteht aus 4 Polypeptiden, die als I, II, III und IV bezeichnet werden [5, 7, 37].

In Abbildung 4 sind die Proteinkomplexe in der Thylakoidmembran dargestellt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 4: Verteilung der photosynthetischen Proteinkomplexe zwischen den gestapelten und ungestapelten Bereichen der Thylakoidmembran [7].

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