Proteine im Phloem: Eine phytopathologische Untersuchung

3 Einleitung

Pflanzen sind eine der wichtigsten Grundlagen für die Existenz von Leben auf unserer Erde. Ihnen werden zwei bedeutende Funktionen zugeschrieben. Erstens sind Pflanzen der element­are Baustein der Vegetationsdecke und stellen eine Nahrungsquelle für Tiere, Pilze und Mikro­ben dar. Zweitens dienen sie als Nutzpflanzen der menschlichen Ernäh­rung. Aus diesem Grund ist der Mensch abhängig von einer ertragreichen Pflanzenproduktion. Vor allem nimmt diese Abhängigkeit angesichts der globalen Bevölkerungs­entwicklung zu, da die Landwirtschaft zwangsläufig weiter intensiviert werden muss. Des Weiteren ist das heutige Wissen über die Nutzpflanzenproduktion noch sehr gering und es bestehen erhebliche internationale Unterschiede im Anbau der Kulturen. Durch diese Problematik entstehen Hungersnöte in vielen Entwicklungsländern, während potenzielle Erträge meist nicht erreicht werden können. Diese Umstände verdeutlichen, dass Forschung und Entwicklung für die pflanzliche Erzeugung essenziell sind.

Pflanzen sind konstant abiotischen und biotischen Stressbedingungen ausgesetzt, weshalb sie sich in ihrer Entwicklung diverse Abwehrmechanismen angeeignet haben (Hallmann, J. et al. 2007). Diese Abwehrmechanismen entstehen zum größ­ten Teil durch die Interaktion zwischen Pflanzen und Pathogenen. Die Pflanze schützt sich vor Bakterien, Viren und Pilzen durch strukturelle, biochemische oder chemische Mecha­nismen. Als Reaktion darauf entwickelten sich bei den Pflanzenpathogenen mit der Zeit mehrere Formen der Be­siedlung und Penetration in die Pflanze. Insbesondere die Blätter und Wurzeln stehen im engen Kontakt mit Pathogenen, da hier natür­liche Öffnungen (Stomata, Lentizellen, Nektarien) und Wunden vorhanden sind (Buchanan, B. et al. 2000).

3.1 Pflanzliche Abwehrmechanismen

Die Pflanze besitzt spezifische Abwehrstoffe, die sie gegen Schaderreger einsetzt. Manche Abwehrstoffe können schon vor der Besiedlung in der Pflanze vorhanden sein (präinfektionell), andere wiederum durch einen Angriff aktiviert werden (postinfektionell). Präinfektionelle Barrieren sind zum Beispiel die Kutikula, die Zell­wand und abschreckende Stoffe (Toxine), welche die Pflanze vor einem Befall beschützen. Bei den postinfektionellen Barrieren gibt es Papillen, PR-Proteine und Phytoalexine, die durch den Angriff von Pathogenen ausgelöst werden. Für diese Gruppe der Abwehrstoffe, die akti­viert und induziert werden, benötigt die Pflanze bestimmte Erkennungsmechanismen. In die­sem Fall sind es so genannte Elicitoren, die durch den Schaderreger, wie Pilze, Oomyzeten und Bakterien abgegeben werden (Hallmann, J. et al. 2007).

3.1.1 Elicitoren

Pathogene setzen z. B. Toxine, Peptide oder Fettsäuren frei, welche die Pflanze mithilfe von Rezeptoren erkennen kann. Durch das Binden dieser Elicitoren an spezifische Rezeptoren werden Signalkaskaden ausgelöst, die der Abwehr der Pflanze dienen. Diese Sub­stanzen können eine Hypersensitivitätsreaktion (HR) auslösen, wodurch ein Zelltod der infizierten Zelle stattfindet. Bei diesem Mechanismus soll die Verbreitung des Pathogens unter­bunden werden. Die Hypersensitivitätsreaktion aktiviert ebenfalls weitere Signale wie z. B. Salicylsäure oder induziert PR-Proteine (Chitinasen, Proteasen) (Hallmann, J. et al. 2007). Es existieren generelle und spezifische Elicitoren. Bei Ersteren spricht man von Microbe-associated-molecular-patterns (MAMPs), die durch spezifische Oberflächen­strukturen des Pathogens mithilfe von Pattern-Recognition-Receptors (PRRs) von der Pflanze erkannt werden (Nürnberger, T. et al. 2002).

3.1.2 Microbe-associated-molecular-patterns (MAMPs)

Durch die Erkennung von MAMPs werden in der Pflanze Signalkaskaden ausgelöst. Es exis­tieren verschiedene MAMPs, wie zum Beispiel Harpine oder Flagellin von Pseudomonas syringae, die bakterielle Proteine darstellen. In den Zellwänden von Pilze kommt das Polysaccharid Chitin vor, das ebenfalls eine Pflanzenabwehr hervorrufen kann. Aber auch bei den Oomyceten sind MAMPs vorhanden, vor allem in den Gat­tungen Phytophtora und Pythim, gibt es verschiedene Abwehr auslösende Zellwandproteine (Nürnberger, T. et al. 2002).

Die MAMPs werden durch spezifische Oberflächen­strukturen des Pathogens mithilfe von PRRs von der Pflanze erkannt (Nürnberger, T. et al. 2002) wodurch in der Pflanze Signalkaskaden – sogenannte Pattern-Triggered-immunity (PTI) – ausgelöst werden.

Einen gut untersuchten Mechanismus der PTI (horizontale Resistenz) stellt die Erkennung des bakte­riellen Flagellins (flg22) durch Flagellin-Sensing-2-Rezeptoren (FLS2-Rezep­toren) dar (Boller, T. et al. 2009). Durch die Bindung des flg22 an den FLS2-Rezeptor (Gómez-Gómez, L. et al. 2001) bildet dieser einen Komplex mit einer Brassinosteroid-Insensitive 1-Associated Kinase 1 (BAK1). Dieser aktivierte Komplex löst unter anderem einen lokalen Anstieg von Ca2+ im Cytosol aus (Blume, B. et al. 2000). Es wird vermutet, dass der Ausbruch von Ca2+ ein Aktivator für die Ca2+-abhängige NADPH-Oxidase ist (Ogasawara, M. A. et al. 2008), die für die Entstehung von Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) benötigt wird. Diese ROS sind wahrscheinlich Signale, die innerhalb der PTI ablaufen und sowohl lokal als auch systemisch weitere Immunreaktionen auslösen können, um eine weitere Ausbreitung des Erregers zu verhindern (Hallmann, J. et al. 2007).

Als Antwort auf das hochsensible Abwehrsystem der Pflanzen haben viele Pathogene Effektoren entwickelt, die als sogenannte Suppressoren die Immunantwort der Pflanze unterdrücken, sodass sie die Besiedlung durch einen Pathogen nicht „bemerkt“. Im Unterschied zur PTI beschreibt die Effector-Triggered-Immunity (ETI) eine direkte oder indirekte Interaktion des Pathogens mit der Pflanze. Damit ein Patho­gen die PTI unterdrücken kann, benötigt es Effektoren oder Toxine (Schwessinger, B. et al. 2008), mittels derer es die natürlichen Barrieren der Pflanze überwinden kann. Jedoch entwickelten die Pflan­zen diverse Resistenzen gegen einige Effektoren. Diese Art der vertikalen Resistenz baut auf der Gen-für-Gen-Hypothese auf. Diese Theorie besagt, dass die Pflanze mehrere Resistenz-Gene (R-Gene) hat, zu denen es passende, komplementäre Avirulenz-Gene (AVR-Gene) im Pathogen gibt. Aus dieser Interaktion entsteht eine Hypersensitivitätsreaktion (HR), die zu ei­nem rapiden lokalen Zelltod führt (Boller, T. et al. 2009).

Neben dieser lokalen Reaktion der Pflanze ist auch eine systemische Ausbreitung von Signalen möglich. Diese Signale bewirken, dass bei einem Befall mit einem Pathogen auch an den nicht befallenen Stellen Resistenzen entstehen (systemisch erworbene Resistenz). Die systemischen Signale sorgen dafür, dass die Pflanze in Alarmbereitschaft versetzt wird. Eine wichtige Rolle spielen hierbei Jasmonsäure, Ethylen und Salicylsäure (Pieterse, C. M. J. et al. 2009). Als Folge der systemischen Resistenz wird die Pflanze sensibilisiert und kann bei einem erneuten Angriff von Pathogenen schneller reagieren (Hallman, J. et al. 2007).

Damit die Pflanzen auf Angriffe zeitnah reagieren können, muss eine Koordination zwischen verschiedenen Pflanzenteilen, zum Teil über große Strecken, gewährleistet sein. Um eine solche Kommunikation zwischen Wurzel und Spross zu ermöglichen, entstand im Laufe der Evolution das Vaskularsystem, dass aus zwei Leitbahnen besteht. Diese Leitbahnen werden Xylem und Phloem genannt. Beide Leitsysteme dienen zudem als Verteiler von Assimilaten und Wasser in der Pflanze. Das Xylem ist aus toten Zellen (Tracheen, Tracheiden) aufgebaut und die Xylemelemente gehören zum Apoplasten. Das Phloem hingegen besteht aus lebendigen Zell­en (Siebelemente, Geleitzellen) und die Phloemzellen werden dem Symplasten zugeordnet. Durch die Möglichkeit Phytohormone transportieren zu können, ermöglichen sowohl Xylem als auch Phloem eine Signalkette zwischen Wurzel, Spross und Blättern (Schubert, S. 2006). Im Phloem werden aber nicht nur Phytohormone und Photoassimilate transportiert, sondern auch essenzielle Stoffe, vor allem stickstoffhaltige Verbindungen (Aminosäuren, Amide, Nukleotide), organische Säuren (Fettsäuren), anorganische Ionen, Proteine, Fette und RNAs (van Bel, A. J. E. et al. 2003). Diese essenziellen Stoffe sind wichtig für die Entwicklung der Pflanze und dienen ebenfalls als Informations- oder Signalmoleküle (Ruiz - Medrano, R. et al. 2001). Damit nimmt das Phloem im Überleben der Pflanze eine besondere Stellung ein.

3.2 Das Phloem

Das Leitgewebe Phloem besteht aus Siebelementen (SE) und Geleitzellen (CC), die sich aus einer gemeinsamen Mutterzelle differenziert haben. Die Siebelemente bilden Sieb­röhren, die durch Siebplatten (SP) verbunden sind. Durch teilweise Auflösung der Zellwände befinden sich in den Siebplatten diverse Siebporen. Diese Siebporen ermöglichen mit einem Durchmesser von ca. 1 µm, einen kontinuierlichen Massenstrom, der den Transport von Substanzen von Zelle zu Zelle und so in der gesamten Pflanze ermöglicht.

Am Ende der Ontogenese weisen die Geleitzellen (CC) ein dichtes, hochaktives Cytoplasma mit einem vergrößerten Kern und zahlreichen Mitochondrien auf. Jedoch erfahren die Zellen des Siebelements (SE) einen anderen Prozess, der als programmierter Zell-Halbtod bezeichnet wird. Bei diesem Prozess zerfällt der Kern, die Vakuolenmembran und das Cytoskelett bilden sich zurück und Ribosome, Golgi-Apparat und Mitochondrien werden reduziert. Nach dieser Entwicklung bleiben die Plasmamembran und eine dünne randständige Cytoplasmaschicht, das Endoplasmatische Retikulum (ER) sowie phloemspezifische Plastiden und P-Proteine übrig (van Bel, A. J. E. et al. 2003). Durch diese Reduktion haben die Siebelemente die Fähigkeit verloren eigenständig für ihren Erhalt zu sorgen. Diese Aufgabe wird daher von den Geleitzellen übernommen, wodurch die Sieb­elemente und die Geleitzellen einen gemeinsamen Komplex (SE/CC) eingehen, der über Plasmodesmen ver­knüpft ist (Schubert, S. 2006).

3.2.1 Nährstofftransport im Phloem

Zwischen dem Xylem und dem Phloem herrschen zwei unabhängige Mechanismen der Nährstoffverlagerung, obwohl beide Transportwege parallel verlaufen. Die Verlagerung im Xylem ist einseitig und verläuft akropetal. Im Phloem existiert hingegen ein selektiver und auch energieabhängiger basipetaler Transport (Buchanan, B. et al. 2000).

Dabei herrschen im Phloemsaft verschiedene Zusammensetzungen von Inhaltsstoffen. Die höchsten Konzentrationen sind vor allem bei Saccharose, Aminosäuren und Kalium. Niedrige Konzent­rationen sind bei Bor, Calcium und Ammonium vorhanden. Durch diese niedrigen Konzent­rationen kann es oft zu physiologischen Mangelkrankheiten kommen. Daher können Krankheiten wie Spitzendürre, Fruchtendfäule und Stippigkeit auftreten (Schubert, S. 2006).

Erklärt wird der Langstreckentransport im Phloem durch die Druckstromtheorie nach Münch E. (1930). Diese besagt, dass der Fluss der Stoffe auf der Differenz des osmotischen Drucks zwischen den verschiedenen Bereichen des Phloems beruht, wodurch Nährstoffe von „source“ zu „sink“ verlagert werden. Das „source“ dient hierbei der Aufnahme von Photoassimilaten und Phytohormonen (Beladungsphloem) und das „sink“ hat die Aufgabe, diese aufgenommenen Assimilate oder Phytohormone abzu­geben (Entladungsphloem). Die Sinkaktivität ist hierbei der bestimmende Faktor über den Ort der Entladung im Phloem. Durch dieses Phänomen können Nährstoffe in der Wurzel sowie im Spross verteilt werden (van Bel, A. J. E. et al. 2003). Die Theorie des isolierten Massenstroms wird seit langer Zeit als Ursache für die Nährstoffverlagerung gesehen. Jedoch wird bei diesem Mechanismus nicht berücksichtigt, dass die Siebröhren durchlässige, schlecht isolierte Einheiten sind. Wegen dieser Eigenschaft können Makro- und Mikromoleküle entlang des Phloems aufgenommen und abgegeben werden. Dieses Konzept führt dazu, dass ein dauerhafter Austausch von Molekülen zwischen Siebelementen und an­grenzenden Zellen entsteht (van Bel, A. J. E. et al. 2011).

Aufgrund dieser Abgabe- und Aufnahmetransporte (release/retrival) im Phloem können Mikromoleküle zwischen den Siebelement/Geleitzellen (SE/CC) Komplexen und Parenchymzellen unter source-begrenzen­den Bedingungen übertragen werden („apoplasmatic hopping“). Es wird vermutet, dass auch Makromoleküle zwischen Siebelementen und Geleitzellen verteilt werden, durch ein „symplasmatic hopping“. Im Gegensatz zu den Mikromolekülen werden Makromoleküle durch Pore-Plasmodesmos-Units (PPU) reguliert. Das „molecular hopping“ bietet eine flexiblere Verteilung von Mole­külen in der Pflanze als der Massenstrom. Durch das „symplasmatic hopping“ wird die Verlagerung von Makromolekülen in der ganzen Pflanze dynamischer und mobiler. Ebenfalls könnte dieser Mechanismus eine große Bedeutung für die sys­temische Signalübertragung im Phloem darstellen, womit auch Phytohormone transportiert werden könnten (van Bel A. J. E. et al. 2011).

3.3 Verschluss der Siebelemente

Durch den großen Druck im Phloem und die Verkettung der Siebelemente hätte bereits eine kleine Verletzung der Siebelemente zur Folge, dass Phloemsaft und somit wertvolle Energie und Bausteine in großem Maße austreten könnten. Zudem könnten Mikroorganismen und entstehende Toxine sich ungehindert in der gesamten Pflanze ausbreiten. Jedoch hat die Pflanze verschiedene Schutz- und Verteidigungsmechanismen entwickelt, einen Verlust des essenziellen Phloemsafts und eine Verbreitung von Pathogenen zu verhindern. So ist die Pflanze in der Lage durch vorsorglich synthetisierte Substanzen, wie phloemspezifische Proteine (P-Proteine) und anderen rasch synthetisierte Stoffe, wie Callose, die Siebelemente bei einem Befall vorrübergehend zu verschließen (van Bel, et al. 2003).

Durch diesen Verschluss schützen sich Siebelemente lokal und können zudem systemisch den weiterer Transport des Pathogens und/oder der entstehenden Toxine stoppen. Einzuordnen ist der Verschluss der Siebelemente wahrscheinlich als ein Signal innerhalb der Immunreaktion der Pflanze. Dafür spricht der Einfluss von Ca2+ und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) beim Verschluss der Siebelemente. Diese Moleküle sind nachweislich an der Immunreaktion der Pflanze auf Pathogenbefall beteiligt (Gaupels, F. et al. 2008).

3.3.1 P-Proteine in den Siebelementen

Bei einer Verletzung des Phloems werden P-Proteine vom Phloemstrom mitgerissen, wodurch die Proteine die Siebplatten verstopfen. Durch die Verstopfung werden die darauffolgenden Siebelemente vor zu großem Turgordruck beschützt, sowie ein zu großer Phloemsaftverlust verhindert. Weiterhin entsteht eine Barriere für potenzielle Phytopathogene und ihre Toxine.

Der Phloemsaft enthält eine große Vielfalt an Proteinen, die als Sieve Tube Exudate Proteins (STEPs) bezeichnet werden. Es exis­tieren ungefähr 100 bis 200 Proteine im Phloem. Einige Proteine zirkulieren zwischen den Siebelementen und den Geleitzellen und werden in den Geleitzellen synthetisiert. Zu den STEPs gehören auch Teile von Strukturproteinen. Eine wichtige Gruppe sind die im Phloem mobil verlagerten Phloem-Proteine (P-Proteine) (Buchanan, B. et al. 2000). Je nach Art und Entwicklungsstadium gibt es unterschiedliche Zusammensetzungen und Strukturen von P-Proteinen, wie granuläre, filamentöse, fibrilläre, kristalline oder tubuläre Proteine (Sabnis, D. D. et al. 1979; Dannenhoffer, J. M. et al. 1997).

Die am besten erforschten P-Proteine sind Phloem-Protein 1 (PP1) und Phloem-Protein 2 (PP2) in C ucurbita maxi­ma. Beide PPs werden in den Geleitzellen synthetisiert und im Siebelement mithilfe von Pore-Plasmodesmos-Units (PPU) transportiert (Knoblauch, M. et al. 2008). Eine weitere besondere Form der P-Proteine sind die sogenannten Forisome. Diese kristallinen, spindelförmigen Proteine im Phloem der Fabaceae sind ebenfalls am Verschluss der Siebelemente (SEO) beteiligt (van Bel, A. J. E. et al. 2003).

3.3.1.1 Proteine in Cucurbita maxima (PP1 und PP2)

Die häufigsten Proteine im Phloemsaft von Cucurbita maxima sind PP1 und PP2 (Bostwick D. E. et al. 1992). PP1 ist ein filamentöses Protein, welches je nach pH-Wert unterschiedliche strukturelle Formen annehmen kann. Diese Formen können sich neben ihrer Funktion auch in ihrer Größe unterscheiden, wodurch PP1 von 80 bis 136 kDa groß sein kann (Leineweber K. et al. 2000). PP2 ist ein 47 kDa großes komplexes Lektin (Clark A.M. et al. 2003).

Diese Proteine werden durch Verletzung der Pflanze oder in Gegenwart von Sauerstoffzugabe zu unlöslichen, ausgeflockten Komplexen, die durch Agglutination die Siebröhren verstopfen (Furch, A. C. U. et al. 2010) und somit am Verschluss der Siebplatten beteiligt sind.

3.3.1.2 Forisome in Vicia faba

Eine besondere Form der Phloem-Proteine nehmen die Forisome an. Diese non-dispertiven P-Proteine treten nur innerhalb der Siebelemente der Familie der Fabaceae (Schmetterlingsblütengewächse) auf und sind wie andere P-Proteine am Verschluss der Siebelemente beteiligt. Gebildet werden die ca. 28,5 µm langen und ca. 3,1 µm breiten Forisome (Peters W. S. et al. 2006) durch einzelne Untereinheiten, den Forisometten (Tuteja N. et al. 2009). Diese Einheiten werden wiederum aus mindestens drei verschiedenen Proteinen mit einem Molekulargewicht von etwa 70-80 kDa gebildet (Noll G. A. et al. 2006), welche durch die so genannten SEO Gene (Sieve Element Occlusion) kodiert werden (Pélissier H. C. et al. 2008).

Forisome sind die ersten P-Proteine mit bekannten physiologischen Funktionen und stellen eine neue Gruppe von ATP-unabhängigen Proteinen dar (Knoblauch M. et al. 2003). Für die Wissenschaft sind das interessante Eigenschaften, da somit neue Perspektiven in der Biotechnologie ergründet werden können (Peters W. S. et al. 2007). Diese Technik könnte zum Beispiel Anwendung finden in Biosensoren oder auch in der Luft- und Raumfahrt (Shen A. Q. et al. 2005).

Besonders ist an diesen Proteinen, dass sie rasch auf Calcium (Ca²+) Konzent­rations­änderungen in den Siebelementen reagieren und durch reversible Konformationsänderungen den Durchfluss im Phloem kontrollieren (Furch A. C. U. et al. 2007; Pélissier, H. C. et al. 2008). Ein solcher Ca2+-Einstrom kann durch Verletzungen, Befall, Hitze, Kälte, PH-Wert und osmotischen Ver­änderungen entstehen (Furch A. C. U. et al. 2007; Thorpe, M. et al. 2009; Gaupels F. et al. 2008). Bei dem Prozess der Konformationsänderung wird das lange kristalline, spindelförmige Forisom zu einem eiförmigen, pfropfenartigen Protein­körper verformt, wodurch eine Verkürzung (von ca. 30 %), aber auch eine Volumenzunahme (von ca. 110 %) des Forisoms entsteht. Betrachtet man den zeitlichen Verlauf der Forisomreaktion, so kann gesagt werden, dass diese im Vergleich zu anderen Verschlussmechanismen, eine sehr frühe Reaktion einnimmt (Furch A. C. U. et al. 2007). So wird bei einem Reiz oder Stresssituation, wie zum Beispiel dem Anbrennen eines Blattes, eine Dispersion bereits 15 bis 45 Sekunden nach Reizapplikation erkenn­bar. In diesem disper­gierten Zu­stand verstopft das Forisom die Siebplatte und verhindert einen Massenstrom im Phloem. Erst nach ca. 7 bis 15 Minuten rekondensiert das Forisom wieder und gibt den Massenstrom im Phloem frei. Während dieser Rekondensation wiederum tritt Callose in den Sieb­poren auf und verhindert ihrerseits einen geregelten Massenstrom.

3.3.2 Verschluss der Siebelemente durch Callose

Callose ist ein β-1,3-Glucan-Polymer und entsteht in unterschiedlichen Pflanzengeweben (u.a. Plasmodesmen und Siebplatten im Phloem). Die Ca2+-abhängige Callose-Produktion durch Verletzungen oder Verwundungen der Pflanze führt wie der proteinvermittelte Verschluss zu einem Verschluss der Siebplatte. Betrachtet man hier jedoch den zeitlichen Verlauf der Callose-Bildung, so kann erwähnt werden, dass diese im Vergleich zu anderen Verschlussmechanismen eine sehr späte Reaktion einnimmt (Furch A. C. U. et al. 2007). So erreicht die Bildung von Callose ihr Maximum nach ca. 20 Minuten und degeneriert erst wieder nach etwa 1 bis 2 Stunden (Furch, A. C. U. et al. 2007).

4 Ziel der Arbeit

In der Pflanze existieren verschiedene Arten von Abwehrreaktionen auf biotische Reize. Die systemische Route von Abwehrreaktionen verläuft vermutlich über das Phloem und wird vorwiegend über vorsorglich synthetisierte Substanzen, wie phloemspezifische Proteine (P-Proteine) organisiert. Daher liegt der Schwerpunkt dieser Arbeit in der Untersuchung der proteinvermittelten Verschlussmechanismen im Phloem.

Im Fokus der Arbeit stehen die physiologischen Veränderungen der Forisome in Vicia faba nach MAMP-Applikation. Ziel dieser Methode war es, eine Reaktion der Forisome auf MAMPs zu generieren und somit einen Beweis für eine Abwehrantwort der Pflanze zu erhalten. Durch die Versuche sollte gezeigt werden, das Forisome ebenfalls eine Reaktion der Pattern-Triggerd-Immunity (PTI) sind. Des Weiteren sollten auch die Phloem-Proteine PP1 und PP2 von Cucurbita maxima auf eine MAMP-Reaktion überprüft werden, die eine Abwehrreaktion der Pflanze auf MAMP-Applikation beweisen würde.

Mit Hilfe dieser Untersuchungen sollte der Verschluss der Siebplatten identifiziert werden, um somit die Mechanismen des Verschlusses nach Befall zu verstehen.

5 Material

5.1 Pflanzenmaterial

Abb. 1: Vicia faba (links) und Cucurbita maxima (rechts) –Versuchspflanzen im Gewächshaus des IFZ

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Untersuchung der Forisome wurde an Pflanzen der Familie der Hülsenfrüchte (Faba­ceae), hier speziell Vicia faba, durchgeführt. Weitere Untersuchungen an den Phloem-Proteinen PP1 und PP2 an Cucurbita maxima. Die Pflanzen wurden bei einer Temperatur von 24 °C (Tag) und 18 °C (Nacht), einer Luftfeuchtigkeit von 64 % und einer täglichen Bestrahlung (Philips SONT 2,8 lm/mW) von 16 Stunden im Gewächshaus aufgezogen. Vor Verwendung wurden die Pflanzen auf Parasitenbefall, Blütenbildung und Verletzungen untersucht.

Vicia faba -Pflanzen wurden in Kunststofftöpfen mit ca. 8 cm Durchmesser im Gewächshaus (IFZ) unter oben erwähnten Standardbedingungen kultiviert. Die Pflanzen konnten nach der Aussaat ca. 25 bis 28 Tage wachsen, bevor sie für die Experimente genutzt wurden. Somit waren die Pflanzen bei den Experimenten noch in der vegetativen Phase. Die Cucurbita maxima -Pflanzen wurden in größeren Kunststofftöpfen mit ca. 15 cm Durchmesser im Gewächshaus (IFZ) unter oben erwähnten Standardbedingungen kultiviert. Die Pflanzen konnten ca. 28 Tage nach der Aussaat wachsen.

5.2 Lösungen

Die verwendeten Chemikalien wurden, sofern nicht anders vermerkt, von Invitrogen, Merck, Roth und Sigma Aldrich bezogen.

5.2.1 Puffer

Apoplasmatischer Puffer: pH 5,7/NaOH

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

5.2.2 Farbstoffe

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

5.2.3 Verbrauchsstoffe

- destilliertes Wasser (H2Odest)

- Ethanol (EtOH)

5.2.4 Microbe-associated-molecular-patterns (MAMPs)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

5.4 Geräte

5.4.1 Mikroskopie

DMLFS Leica (40-fach Wasserobjektiv)

Konfocal-Laser-Scanner-Mikroskop (KLSM) von Leica (63-fach Wasserobjektiv)

5.4.2 Software

Photoshop CS6 (Adobe)

Excel (Microsoft 2007)

Word (Microsoft 2007)

Power Point (Microsoft 2007)

Adobe Illustrator CS6

5.5 Verbrauchsmittel

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

6 Methoden

6.1 Beobachtung im intakten Gewebe (in-vivo- Technik )

Für die Untersuchung der Forisome im Phloem wurden die intakten Versuchspflanzen mithilfe von Rasierklingen präpariert. Hierbei wurde die Hauptader eines älteren Blatts der Vicia faba -Pflanzen genutzt. Die ersten Zellschichten wurden vorsichtig abgetragen, um das intakte Phloem zu beobachten. Diese in-vivo -Technik von van Bel, A. J. E. und Knoblauch, M. (1998) ermöglicht, Reaktionen von Forisomen im unversehrten Pflanzengewebe zu untersuchen. Die Reaktionen wurden durch Anbrennen der Blattspitze oder durch verschiedene MAMP-Applikationen ausgelöst. Außer den Beobachtungen mittels durchlicht-mikros­ko­pi­scher Aufnahmen wurden zusätzliche Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt.

6.1.1 Aufbereitung der intakten Versuchspflanzen

Für eine in-vivo -Beobachtung des intakten Phloems (Abb. 2 und 3) wurden vorsichtig die darüber liegenden Zellschichten abgetragen. Dabei ist es wichtig, dass die Vicia faba- Pflanzen gesund und unverletzt sind, um Verfälschung der Bobachtung durch ungewollte Stressreaktionen zu erhalten. Durch behutsames Schneiden mit Rasierklingen an der Hauptader eines älteren Blatts wurde das Phloem freigesetzt. Der Abstand zwischen dem Sichtfenster und der Blattspitze betrug etwa 3 bis 5 cm. Des Weiteren musste berücksichtigt werden, dass noch mindestens 1 bis 2 Zellschichten über dem Phloem erhalten bleiben, um zu garantieren, dass das Phloem nicht durch einen zu tiefen Schnitt beschädigt wurde. Durch einen Schnitt bis ins Xylem würden auch hier die Beobachtungen der Forisome verfälscht werden. Wenn der Schnitt optimal ist, wird das präparierte Blatt mit der Unterseite mittels doppelseitigen Klebebands auf dem Objektträger fixiert. Um ein Austrocknen des Phloems zu vermeiden, wurde ein apoplasmatischer Puffer auf die Schnittstelle aufgetragen.

Durch ein Mikroskop mit Wasserobjektiv wurde der physiologische Status des Phloems überprüft. Nach einer Ruhephase von ca. 1 bis 2 Stunden konnte die vollständige Funktionsfähigkeit der Forisome gewährleistet werden. Ab diesem Zeitpunkt konnten dann verschiedene MAMPs appliziert und untersucht werden (Furch, A. C. U. et al. 2007).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2: in-vivo -Technik des intakten Phloems

Die linke Abbildung veranschaulicht die in-vivo -Technik im intakten Phloem. Die rechte Abbildung zeigt eine fixierte intakte Versuchspflanze und das Mikroskop (KLSM).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3: Darstellung der in-vivo -Technik bei Vicia faba

Die Abbildung verdeutlicht, mit welcher Technik in der vorliegenden Arbeit gearbeitet wurde. Diese Methode wurde bei den Versuchspflanzen von Vicia faba eingesetzt.

6.1.1.1 Forisomreaktion durch einen Brennreiz

Durch das Anbrennen der Blattspitze mittels Streichhölzern (Abb. 4) wurde ein starker Reiz für die Pflanze ausgelöst. Somit konnte eine reversible Dispersion der Forisome beobachtet werden. Hierbei musste gewährleistet sein, dass die Pflanze ca. 1 bis 2 Stunden Ruhephase nach dem Schnitt hatte. Nach dieser Regenerationszeit wurde die Blattspitze angebrannt. Der Abstand zwischen dem Sichtfenster und der Blattspitze betrug ca. 3 bis 5 cm (Furch, A. C. U. et al. 2007). Die Behandlung mit der Flamme an der Blattspitze dauerte etwa 3 Sekunden (Thorpe, M. R. et al. 2009). Die Technik diente dazu, den Schnitt ins Phloem und die Behandlung der Pflanze zu überprüfen. Nach mehrmaliger erfolgreicher Dispersion der Forisome konnte der Brennreitz gegen MAMPs als potenzieller Reizauslöser ausgetauscht werden. Beobachtung der Forisomreaktion erfolgte durch KLSM (Leica) mit einem 63x-Wasserobjektiv und mit einem DMLFS-Mikroskop (Leica) mit 40x-Wasserobjektiv.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 4: Brennreiz an Vicia faba

Der Brennreiz mittels Streichhölzern diente der Überprüfung der Funktionsfähigkeit der Forisome. Durch diese Methode sollte der physiologische Status der Pflanze überprüft werden.

6.1.1.2 Forisomreaktion durch MAMPs

Durch die Zugabe von MAMPs auf die Schnittstelle des Blatts wurde eine Forisomreaktion hervorgerufen. Bei dieser Methode wurden Flagellin (flg22) und Chitin (glc8) als potenzielle Auslöser einer Reaktion getestet. Hierzu wurde der zuvor aufgetragene apoplasmatische Puffer, der die Pflanze vor dem Austrocknen schützt und ein Abbild des Zellwandbereiches im Phloem darstellt, gegen die MAMPs ersetzt. Nach Auffinden von Forisomen im Phloem wurde eine Ruhephase von etwa 1 bis 2 Stunden eingehalten. Erst danach konnten der apoplasmatische Puffer abgetragen und die MAMPs appliziert werden.

Bei flg22 wurden 1,25 µM auf das vorher präparierte Blatt aufgetragen und anschließend wurden die Forisome 15 bis 30 Minuten beobachtet, um eine Konformationsänderung zu untersuchen. Während einer Dispersion der Forisome wurde etwa 1 Stunde gewartet, ob und wann eine Rekondensation der Forisome eintritt. Der gleiche Versuchsablauf wurde auch bei der Untersuchung von glc8 beachtet. Hierbei wurde zuerst die Konzentration von 0,1 µM getestet. Bei einer weiteren Versuchsreihe mit Chitin wurde die Konzentration auf 1 µM erhöht. Beobachtung der Forisomreaktion erfolgte auch hier durch KLSM (Leica) mit einem 63x-Wasserobjektiv und mit einem DMLFS-Mikroskop (Leica) mit 40x-Wasserobjektiv.

6.1.1.3 Färbung des Phloems

Bei einer Einfärbung der Schnitte musste darauf geachtet werden, dass die Konzentration und die Inkubationszeit der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe optimal sind. Ebenfalls unterliegen die Farbstoffe unterschiedlichen Anwendungen.

Die Versuchspflanzen wurden mit 5- und 6-carboxylfluorescein diacetate (CFDA), mit 5-chloromethyleosin diacetate/5-chloromethylfluorscein diacetate (CMEDA/CMFDA) und 4-amino-5-methylamino-2,7-difluorescein (DAF-FM) behandelt. Bevor die Farbstoffe aufgetragen wurden, musste zuerst der Schnitt ins intakte Phloem erfolgen.

Der Farbstoff CFDA wurde über einen zusätzlichen Schnitt mittels Rasierklinge an der Blattspitze beladen. Auf die abgeschnittene Blattspitze wurde der Farbstoff CFDA in akropetaler Richtung aufgetragen. Die Inkubationszeit betrug etwa 60 bis 90 Minuten (Hafke, J. B. et al. 2005). CFDA wird als Marker für die Darstellung des symplasmatischen Transports eingesetzt, da dieser Farbstoff im Phloem mobil verlagert wird. CFDA strömt durch die Plasmamembran in basipetaler Richtung und akkumuliert in den Siebelement/Geleitzellen-Komplexen (SE/CC). Jedoch zeigt sich, dass sich der Farbstoff homogen im Siebelement verlagert, aber in den Geleitzellen stärker und auch gleichzeitig heterogener verteilt wird. Der Farbstoff wird nach ca. 20 bis 30 Minuten etwa 3 cm nach der Applikation basipetal in Richtung des Sichtfensters transportiert. Das eingefärbte Phloem wurde in vivo mittels KLSM beobachtet (Knoblauch, M. et al. 1998).

Der Fluoreszenzfarbstoff CMEDA/CMFDA erfährt eine andere Anwendung als CFDA und wird direkt auf die Schnittstelle aufgetragen. Die Inkubationszeit betrug etwa 30 Minuten. Hierbei musste darauf geachtet werden, dass zuerst der apoplasmatische Puffer von der Schnittstelle entfernt wird. Nach der Inkubationszeit wurde der Farbstoff wieder abgetragen und mit apoplasmatischem Puffer ersetzt. Somit sollte eine Überfärbung der Schnittstelle verhindert werden. Dieser Farbstoff wurde eingesetzt, um die Forisome besser hervorzuheben und eine Reaktion der Forisome besser zu veranschaulichen (Furch, A. C. U. et al. 2007).

Als weiterer Farbstoff wurde DAF-FM eingesetzt. Bei diesem Farbstoff wurde die gleiche Applikation durchgeführt wie bei CMEDA/CMFDA, denn anders als CFDA wird auch DAF-FM direkt auf die Schnittstelle appliziert. Der Farbstoff hatte eine Einwirkzeit von etwa 30 Minuten. Der Farbstoff ist ein Indikator für die Stickoxid-Produktion (NO-Produktion) im Phloem. Ebenfalls fluoresziert der Farbstoff erst dann, wenn es zu einer Reaktion mit NO kommt. Erst mithilfe eines Reizes wird die NO-Produktion ausgelöst (Gaupels, F. et al. 2008).

Nach dem Auftragen der Farbstoffe CFDA, CMEDA/CMFDA oder DAF-FM wurde die Pflanze, wie oben beschrieben, mit flg22 behandelt. Die Zugabe des MAMPs (flg22) erfolgte direkt auf die Schnittstelle. Daraufhin wurde die Konformationsänderung der Forisome und eine Veränderung der Farbstoffintensität im Phloem beobachtet und mittels Leica Konfocal Software aufgenommen.

6.2 Probenentnahme von Cucurbita maxima

Die Cucurbita maxima- Pflanzen wurden vor der Probenentnahme mit flg22 behandelt, dessen Konzentration 1,25 µM betrug. Hierbei wurden 100 µl flg22 2 cm vom Spreitengrund des Blatts infiltriert. Die Kontrollpflanzen wurden mit 100 µl H2O auf die gleiche Weise behandelt. Bei der Entnahme des Phloemsafts wurden verschiedene Zeitpunkte eingehalten (t = 10 Minuten bis t = 5 Stunden).

Bei der Probenentnahme (Abb. 5) wurde das zweite Blatt oberhalb der Kotyledone (Petiole) mithilfe einer Rasierklinge abgeschnitten. Nach dem Schnitt wurde mit einem saugfähigen Tuch der erste ausströmende Phloemsaft abgetupft, um potenzielle Verunreinigungen (Zellbestandteile) zu entfernen. Erst nach diesem Schritt wurde der Phloemsaft (1 µl) mit einer Pipette entnommen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Probenentnahme erfolgte am zweiten Blatt oberhalb der Kotyledone (Petiole) (2). Mithilfe einer Rasierklinge (3) wurde die Petiole durchtrennt. Durch diesen Schnitt bildeten sich an der Schnittstelle Phloemsafttropfen, die mittels Pipette entnommen wurden.

Abb. 5: Phloemsaftentnahme von Cucurbita maxima

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Der Phloemsaft wurde mit einem Probenpuffer im Verhältnis 1:3 vermengt. Diese Proben wurden daraufhin auf Eis gekühlt. Danach wurde der Phloemsaft für eine eindimensionale SDS-Page verwendet (Furch, A. C. U. et al. 2010).

6.2.1 Eindimensionale SDS-Page

Die Probenentnahme vom Phloem wurde mit einer eindimensionalen SDS-Page nach Lämmli (1970) durchgeführt. Bei dieser Methode wurden die Proteine nach ihren unterschiedlichen Molekulargewichten aufgetrennt.

Die Proteine des Phloems wandern zuerst durch ein Sammelgel (4 %) und danach durch ein Trenngel (12 %) in einem MiniProtean-3-Elektrophorese-System (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA) (Furch, A. C. U. et al. 2010). Bei den Gelen wurde als Erstes das Trenngel (12 %) für 2 Gele hergestellt, da es die untere Phase der SDS-Page darstellt. Unmittelbar vor dem Abfüllen des Trenngels wurden 60 µl APS und 7,5 µl TEMED zur Lösung zugegeben. Diese Zugabe bewirkt, dass das Trenngel auspolymerisiert. Das gleiche Verfahren wurde auch für das Sammelgel (4 %) angewendet. Nach dem Gießen des Trenngels in die entsprechende Halterung wurde es mit EtOH abgedeckt, um ein Austrocknen zu verhindern. Der EtOH wurde später mittels Filterpapier entfernt. Nach dem Trenngel wurde das Sammelgel hergestellt, da es die obere Phase der SDS-Page darstellt. Unterschiede zwischen beiden Gelen liegen vor allem in ihren Acrylamid-Konzentrationen, Porengrößen und auch in der Verwendung verschiedener Puffer. Diese Unterschiede bewirken, dass die Proben zunächst im Sammelgel komprimiert werden, um dann schließlich gleichzeitig im Trenngel nach Größe getrennt zu werden. Nachdem beide Gele auspolymerisiert waren, konnte die Flutung der Gelkammern mit einem Laufpuffer erfolgen. Danach wurde die Beladung der vorher mit einem Probenkamm integrierten Taschen im Sammelgel durchgeführt.

In die erste Tasche wurde der Page Ruler Prestained Protein Ladder (1 µl) Größenmarker eingesetzt. In die zweite Tasche wurde die Probe einer Kontrollpflanze (Kt) pipettiert. In einem ersten Gel wurden anschließend die Proben von 10 Minuten bis 3 Stunden (t = 0,1 h; t = 0,3 h; t = 1 h und t = 3 h) in die Taschen übertragen. Bei den genannten Proben handelte es sich um Kontrollproben mit H2O und Proben der behandelten/gereizten Pflanze mit flg22. In einem zweiten Gel wurden die Taschen mit den Proben von 4 und 5 Stunden (t = 4 h und t = 5 h) pipettiert. Auch hier handelte es sich um Flagellin und Wasser infiltrierte Proben.

Nach der Übertragung der Proben in die Taschen konnte die Elektrophorese gestartet werden. Dabei wurden zuerst eine Stromstärke von 10 bis 15 mA und eine Stromspannung von 100 V eingestellt. Nachdem die Proteine das Sammelgel durchlaufen hatten, wurden die Stromstärke auf 25 bis 30 mA und die Spannung auf 120 V erhöht.

Nach der Proteintrennung durch das Trenngel wurde die Stromzufuhr gestoppt und die Gele konnten vorsichtig entnommen werden, um sie für ca. 30 Minuten in H2Odest zu lagern.

Als weiterer Schritt wurde eine Coomassiefärbung durchgeführt. Die Gele mussten über Nacht in der Coomassielösung überdauern, wodurch die Proteine eingefärbt wurden. Am nächsten Tag wurde die Coomassielösung entfernt und gleichzeitig gegen 25 % igem Methanol als Waschlösung ersetzt. Nach jeweils einer Stunde wurde die Methanollösung ausgewechselt. Die Auswechslung der Waschlösung wurde viermal wiederholt, um die Hintergrundfärbung zu reduzieren.

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