Bedeutung von Blutbestandteilen für die Funktion des Zentralnervensystems des Blutegels
©2011
Diplomarbeit
59 Seiten
Zusammenfassung
Das Zentralnervensystem des medizinischen Blutegels ist ein gut untersuchtes neurophysiologisches Modellsystem. Es ist in einem großen Blutgefäß des Egels lokalisiert und ständig von Blut umspült. Blutegelblut enthält verschiedene organische Säurereste, welche alle Intermediärprodukte des Citratzyklus sind. Der prominenteste organische Säurerest ist Malat.
Die vorliegende Arbeit untersucht die Bedeutung dieser Blutbestandteile für die Funktion des Zentralnervensystems des Blutegels. Des Weiteren wird eine Malat-haltige Ringerlösung entwickelt und getestet, die geeignet ist, die Lebensdauer isolierter Teile des Blutegel-ZNS von einem Tag auf eine Woche zu verlängern, ohne auf Zellkulturmedien zurückzugreifen.
Untersucht wird die Wirkung von Glucose, Pyruvat und Malat auf Funktion und Lebensdauer von Segmentalganglien des Zentralnervensystems des Blutegels. Hierzu wurden isolierte Segmentalganglien von Hirudo verbana in Lösungen mit 10 mM Glucose, 5 mM Pyruvat, 15 mM Malat bzw. einer Lösung, die frei von diesen Substanzen war, aufbewahrt. Zu definierten Zeiten erfolgte eine Bestimmung der elektrophysiologischen Parameter zweier verschiedener Neuronen sowie von Gliazellen mittels intrazellulärer Ableitung und Applikation von Neurotransmittern. Darüber hinaus wurde die mechanische Konsistenz und die lichtmikroskopisch erfassbare Morphologie der Segmentalganglien dokumentiert.
Die vorliegende Arbeit untersucht die Bedeutung dieser Blutbestandteile für die Funktion des Zentralnervensystems des Blutegels. Des Weiteren wird eine Malat-haltige Ringerlösung entwickelt und getestet, die geeignet ist, die Lebensdauer isolierter Teile des Blutegel-ZNS von einem Tag auf eine Woche zu verlängern, ohne auf Zellkulturmedien zurückzugreifen.
Untersucht wird die Wirkung von Glucose, Pyruvat und Malat auf Funktion und Lebensdauer von Segmentalganglien des Zentralnervensystems des Blutegels. Hierzu wurden isolierte Segmentalganglien von Hirudo verbana in Lösungen mit 10 mM Glucose, 5 mM Pyruvat, 15 mM Malat bzw. einer Lösung, die frei von diesen Substanzen war, aufbewahrt. Zu definierten Zeiten erfolgte eine Bestimmung der elektrophysiologischen Parameter zweier verschiedener Neuronen sowie von Gliazellen mittels intrazellulärer Ableitung und Applikation von Neurotransmittern. Darüber hinaus wurde die mechanische Konsistenz und die lichtmikroskopisch erfassbare Morphologie der Segmentalganglien dokumentiert.
Leseprobe
Inhaltsverzeichnis
Ganglions enthält Axone und Dendriten der Neuronen, die hier synaptische Kontakte ausbilden,
sowie zwei große, verzweigte Neuropil-Gliazellen. Von diesem schematischen Aufbau weichen
lediglich das fünfte und sechste Segmentalganglion, die die Geschlechtsorgane innervieren, mit
insgesamt ~ 700 Neuronen ab.
Im Kontext dieser Arbeit sind zwei Typen von Nervenzellen von besonderer Bedeutung. Die zentral
gelegenen, paarigen Retzius-Neuronen sind mit einem Soma von 50 80 µm Durchmesser die
größten Neuronen des Egels (,,kolossale Ganglienzelle", Retzius 1891). Sie sind miteinander
elektrisch gekoppelt, feuern spontan Aktionspotentiale und sind beteiligt an der Koordination der
Schwimmbewegung, Kontrolle des Muskeltonus und der Schleimsekretion (Carretta 1988). Die
Leydig-Neuronen sind deutlich kleiner und liegen peripher vor der Gabelung der Seitenwurzeln.
Auch sie feuern spontan Aktionspotentiale und sind beteiligt an der Modulation des Herzschlags
durch Steuerung der Kontraktion der Lateralgefäße (Arbas & Calabrese 1990).
1.3 Blutzusammensetzung von Hirudo
Die Zusammensetzung des Blutes von Hirudo wurde mehrfach untersucht. Die vorhandenen
5
Abbildung 3: Segmentalganglion des Blutegels.
links: Durchlichtaufnahme von ventral (aus Nicholls Baylor 1968); anterior oben, posterior unten.
Deutlich erkennbar sind die Konturen der Neuronzellkörper. Die Packetgrenzen erscheinen als hellere,
zellfreie Bereiche. Die Konnektive und der Faivre'sche Nerv verbinden die Segmentalganglien
miteinander, die paarigen Seitenwurzeln verbinden das Segmentalganglion mit der Peripherie.
rechts: Schemazeichnung Querschnitt (Nicholls van Essen 1974, nach Coggeshall Fawcett 1964).
Das Neuropil im Zentrum enthält Axone und Dendriten der außen liegenden Neuronzellkörper. Die
Bindegewebskapsel umgibt das Ganglion.
Analysen sind inkonsistent; Haltungsbedingungen, Methodik der Blutentnahme und
Analyseergebnisse variieren teilweise stark.
Nicholls Kuffler (1964) bestimmten den Gehalt von Na
+
zu ~ 130 mM und den von K
+
zu
~ 4 mM, trafen aber keine Aussage zu den vorhandenen Anionen. Boroffka (1968) bestimmte die
ionale Zusammensetzung des Blutes mit 125 mM Na
+
und 36 mM Cl
-
. Somit bestand ein Defizit
von ~ 90 mM negativer Ladungen, das auf das mögliche Vorhandensein mehrwertiger Anionen
zurückgeführt wurde. Zur Klärung dieses Umstands wurde eine Suche nach verschiedenen
Verbindungen durchgeführt, die zum Ergebnis hatte, dass organische Säurereste die wichtigsten
Anionen im Blut von Hirudo medicinalis darstellen (Zerbst-Boroffka 1970). Demnach enthält es
unter anderem Citrat, Laktat, Fumarat und Succinat, jeweils in Konzentrationen zwischen 5 und 15
mM. Das Anionendefizit konnte somit im Rahmen der Messunsicherheit als geklärt betrachtet
werden.
Tabelle 1: Blutzusammensetzung von Hirudo im Ruhezustand. Literaturdaten, gekürzt. Eine vollständige
Zusammenstellung findet sich in Tab. 16 im Anhang.
Konzentrationen in mmol/l, Osmolarität in mOsm/l.
Parameter
Nicholls
Kuffler
(1964)
Boroffka
(1968)
Zerbst-
Boroffka
(1970)
Zebe
et al.
(1981)
Hildebrandt
Oeschger
(1987)
Hoeger
et al.
(1989)
Hildebrandt
Zerbst-
Boroffka
(1992)
Nieczaj
Zerbst-
Boroffka
(1993)
[Na
+
]
130
125
136
125
125
[K
+
]
4,1
6,0
5,7
6,5
[Ca
2+
]
0,5
0,5
[Mg
2+
]
0,6
0,5
[Cl
-
]
36
41
40
[Citrat]
5,1
0,29
0,2
0,1
0,2
[-Ketoglutarat]
1,5
1,3
3,7
3,2
2,9
[Laktat]
14
2,3
3...7
1,1
1,0
5,1
[Pyruvat]
0,09
0,2
0,3
[Fumarat]
10
1,3
1...2
3,5
2,2
2,4
[Succinat]
15
1,4
3...5
0,9
0,6
2,1
[Malat]
9,4
7...13
28
15
12
[Glukose]
0,3
Osmolarität
202
200
201
pH
7,42
7,75
7,6
Zebe et al. (1981) untersuchten Stoffwechselvorgänge des Blutegels in Umgebungen mit
verschiedenem Sauerstoffgehalt. Sie kamen zu dem Ergebnis, dass unter normoxischen
6
Bedingungen ~ 9 mM Malat als einziges organisches Anion in relevanter Konzentration vorhanden
ist. Somit bestand erneut ein starkes Aniondefizit. Dieses Ergebnis wurde von Hildebrandt
Oeschger (1987) weitestgehend bestätigt. Wenning Hoeger (1987) bestätigten erneut Malat als
wichtigstes organisches Kation, fanden jedoch eine Gesamtkonzentration organischer Säurereste
äquivalent zu ~ 83 mM einfach negativer Ladungen, womit das Anionendefizit erneut als
geschlossen betrachtet wurde. Hoeger et al. (1989) bestätigten dieses Ergebnis, stellten aber fest,
dass die Blutzusammensetzung offenbar stark von der Methode der Blutentnahme beeinflusst wird.
Versuche zum Energiestoffwechsel von Hildebrandt Zerbst-Boroffka (1992) und Nieczaj
Zerbst-Boroffka (1993) bestätigten im wesentlichen diese Daten, und stellten zudem fest, dass die
Zusammensetzung des Blutes abhängig ist von der Salinität des Wassers und dem CO
2
-Gehalt der
Luft, in der die Egel gehalten wurden. Die von Zerbst-Boroffka (1970) erhobenen Daten ähneln der
Blutzusammensetzung nach starker Muskeltätigkeit oder nach mehrstündigem Aufenthalt in
Salzwasser. Die genannten Literaturdaten sind gekürzt in Tabelle 1 und vollständig in Tabelle 16 im
Anhang zusammengestellt.
Zusammenfassend lässt sich nach aktueller Datenlage zur Zusammensetzung des Blutegelblutes
feststellen,
dass
Malat
mit
~
15
mM
das
häufigste
Anion,
Na
+
mit ~ 130 mM
das
häufigste
Kation
ist.
1.4 Wirkung von Aufbewahrungsmedien auf isolierte Segmentalganglien
In an den Blutegel angepasster Ringerlösung (,,Normalsalzlösung") beträgt die Lebensdauer
isolierter Segmentalganglien etwa einen Tag (Lucht 1997, Falkenberg 2009). Isolierte Neuronen
überleben in Ringerlösung ~ 2 Tage (Nicholls 1987).
Die Inkulturnahme isolierten Blutegel-Segmentalganglien oder Neuronen ist eine etablierte
Arbeitstechnik. Als Kulturmedium wurde Leibovitz-Medium L-15 zum ersten Mal bei Miyazaki et
al. (1975) für diesen Zweck verwendet. L-15-Medium ist ein Gewebekulturmedium, das zur
Kultivierung von neuronalem Gewebe, aber auch von Invertebraten-Zelllinien geeignet ist (Morton
1970). Es enthält anorganische Salze (Na
+
, Cl
-
, K
+
, Mg
2+
, H
2
PO
4
-
), 17 proteinogene Aminosäuren
(kein Aspartat, Glutamat, oder Prolin), Vitamine aus der B-Gruppe, Galaktose, 5 mM Pyruvat und
weitere Bestandteile in Konzentrationen im µM-Bereich. (Leibovitz 1963).
Dem Medium werden meist 2 10 % fötales Kälberserum (FBS), sowie Antibiotika (z. B.
Penicillin, Ampicillin, Streptomycin) und Antimykotika (z. B. Nystatin, Amphotericin) zugesetzt. In
den meisten Fällen findet sich auch der Zusatz von Glucose, fast immer in einer Konzentration von
30 mM.
7
In diesem Kulturmedium bleiben die elektrophysiologischen Eigenschaften der Neuronen isolierter
Segmentalganglien über ~3 Wochen unverändert, lediglich die Bindegewebskapsel trübt leicht ein
(Miyazaki Nicholls 1976, Ready Nicholls 1979). Isolierte Neuronen können auch ohne
Gliazellen für mehrere Wochen in-situ-Eigenschaften bewahren (Fuchs et al. 1981). Auch ohne den
Zusatz von Glucose wird von einer Haltbarkeit der Zellen von bis zu 3 Wochen berichtet (Nicholls
et al. 1990).
Unabhängig vom Leibovitz-Kulturmedium wurden basierend auf den vorhandenen Analysen
verschiedene Blutersatzlösungen mit unterschiedlichen Anteilen organischer Säureresten
vorgeschlagen. Falkenberg (2009) untersuchte den Einfluss von Blutersatzlösung nach Zerbst-
Boroffka (5 mM Citrat, 15 mM Succinat, 10 mM Fumarat, 10 mM Laktat; vgl. Anhang Tab. 17) auf
das elektrophysiologische Verhalten der Retzius-Neuronen isolierter Segmentalganglien. Es
wurden folgende Ergebnisse erhalten:
Das Ruhemembranpotential (Ruhe-E
m
) der Retzius-Neuronen war am Präparationstag unabhängig
davon, ob sie in Normalsalzlösung (NSL) oder Blutersatzlösung (BEL) aufbewahrt wurden. Das
Ruhe-E
m
brach in NSL innerhalb von drei Tagen praktisch zusammen, während es in BEL stabil
blieb. In BEL werden über einen Zeitraum von mindestens 3 Tagen spontane Aktionspotentiale
gebildet, in NSL lediglich einen Tag. Das Cl
-
-Gleichgewichtspotential (E
Cl
) der Retzius-Neuronen
war in BEL dauerhaft negativer als in NSL. Die mechanische Stabilität und Transparenz der
Bindegewebskapsel der Segmentalganglien blieb in BEL für mindestens 3 Tage erhalten, während
in NSL aufbewahrte Ganglien schnell trüb und brüchig wurden.
Zokoll (2010) stellte fest, dass reduzierte BEL, die nur Citrat, Fumarat oder Succinat enthalten,
ähnlich geeignet sind, die Haltbarkeit isolierter Ganglien zu verlängern, wie vollständige BEL mit
allen Komponenten. Eine reduzierte BEL, die lediglich Laktat als organischen Säurerest enthielt,
hatte hingegen keinen Effekt in diese Richtung. Als mögliche Erklärung für die verlängerte
Haltbarkeit der Ganglien in Gegenwart organischer Säuren wurde die anaplerotische Zuführung von
Citrat, Fumarat und Succinat in den Citratzyklus genannt.
1.5 Fragestellung
Die Lage des Zentralnervensystems des Blutegels im Ventralgefäß legt die Vermutung nahe, dass
die Energieversorgung des Nervensystems über das Blut des Tieres erfolgt (siehe 1.2). Die
Untersuchungen von Falkenberg (2009) und Zokoll (2010), die sich auf eine Analyse der
Blutzusammensetzung von Zerbst-Boroffka stützen (siehe 1.4), haben gezeigt, dass die
8
Lebensdauer isolierter Segmentalganglien in Gegenwart von Citrat, Succinat oder Fumarat deutlich
verlängert war, während Laktat diese Wirkung nicht hatte. Dieser Befund spricht dafür, dass die
Segmentalganglien imstande sind, diese organischen Säurereste aufzunehmen und zu
verstoffwechseln.
Spätere Untersuchungen zeigten jedoch, dass Malat die das primäre organische Anion im
Blutegelblut ist (siehe 1.3). Daher wurde hier untersucht, ob die Gegenwart von Malat die
Lebensdauer isolierter Segmentalganglien ähnlich verlängert, wie Citrat, Succinat oder Fumarat.
Weiterhin existiert eine Vielzahl von Studien, bei denen isolierte Segmentalganglien oder einzelne
Zellen für bis zu 3 Wochen kultiviert wurden. Als Kulturmedium wurde durchweg Leibovitz-15
Medium genutzt (siehe 1.4), dass unter anderem 5 mM Pyruvat enthält. Deshalb wurde hier
ebenfalls untersucht, ob Pyruvat in der Lage ist, die die Lebensdauer isolierter Segmentalganglien
zu verlängern.
Zur Ernährung von Segmentalganglien in Kultur wurde dem Medium häufig Glucose zugegeben, in
der Regel 10 mM in Ringerlösung (Nicholls Baylor 1968) und 30 mM in Leibovitz-Medium. Es
ist aber bekannt, dass Zellen des Blutegel-ZNS auch ohne Glucosezusatz bis zu 3 Wochen in
Leibovitz-Medium kultivierbar sind. Es stellt sich die Frage, ob Glucose tatsächlich geeignet ist,
isolierte Segmentalganglien zu ernähren. Darum wurde hier untersucht, ob Glucose in der Lage ist,
die die Lebensdauer isolierter Segmentalganglien zu verlängern.
Darüber hinaus wurde der Frage nachgegangen, ob Malat, Pyruvat oder Glucose die
elektrophysiologischen Eigenschaften der Zellen isolierter Segmentalganglien verändern.
2 Material und Methoden
2.1 Bezug und Haltung der Blutegel
Verwendet wurden in Serbien und der vorderen Türkei wildgefangene, vom Importeur 32 Wochen
zwischengehaltene und unter der Handelsbezeichnung ,,Medizinische Blutegel: Hirudo
medicinalis/verbana/orientalis" vertriebene Tiere. Alle Versuchstiere wurden anhand ihrer Bauch-
und Rückenzeichnung als H. verbana bestimmt (vgl. Siddall et al. 2007). Während der
Zwischenhälterung wurden die Tiere nicht gefüttert (M. Aurich, Biebertaler Blutegelzucht, pers.
Mitteilung v. 08.03.2011). Die Haltung im Labor erfolgte in luftdurchlässig schließenden
9
Kunststoffschalen, die ~ 2,5 cm hoch mit mit Wasseraufbereitungsmittel versetztem Leitungswasser
gefüllt waren, bei 10 12 °C in einem Kühlschrank. Die Egel waren zum Versuchszeitpunkt adult,
ungestreckt 3 5 cm und gestreckt 9 13 cm lang. Der Magen war bei der Präparation in jedem
Fall mit Blut gefüllt.
2.2 Präparation und Aufbewahrung der Segmentalganglien
Die Blutegel wurden an Bauch- und Kopfsaugnapf mit Stecknadeln in einer Schale mit Wachsboden
festgesteckt und gestreckt. Die Tötung erfolgte durch einen tiefen Schnitt hinter dem Mundsaugnapf
und Durchtrennen der Konnektive zwischen 1. und 2. Segmentalganglion. Das Tier wurde entlang
der dorsalen Medianlinie aufgeschnitten. Die Eröffnung der Leibeshöhle und Präparation des ZNS
erfolgte mittels einer Augenschere unter einem Auflicht-Stereomikroskop (Lucht 1998). An den
einzelnen Segmentalganglien wurde dorsal und ventral je ~ 2 mm Konnektiv, lateral je ~ 1mm
Seitenwurzel belassen. Die isolierten Segmentalganglien wurden in Glasschalen mit je ~ 1,8 ml
Aufbewahrungslösung überführt, mit Uhrgläsern luftdurchlässig abgedeckt und bei 10 12 °C im
Kühlschrank gelagert. Zur Verminderung der Keimbelastung wurde gluscosehaltiges Medium (siehe
2.3) täglich, alle anderen Medien mindestens alle 3 Tage gewechselt.
2.3 Aufbewahrungsmedien
Bei allen Lösungen, die mit dem Inneren der Leibeshöhle sowie dem isolierten ZNS in Kontakt
gebracht wurden, handelte es sich um mit HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-
ethansulfonsäure) gepufferte physiologische Lösungen mit pH 7,4. Alle Aufbewahrungsmedien
dienten bei den Experimenten auch als Superfusionslösung an der Messapparatur.
Zum Ansetzen der Aufbewahrungsmedien wurden folgende Stammlösungen verwendet:
1 M NaCl, 1 M KCl, 1 CaCl
2
, 500 mM MgCl
2
, 1 M HEPES, 100 mM Na-Pyruvat,
100 mM Na
2
-Malat. Der pH-Wert wurde mit 1 M NaOH eingestellt. Eine vollständige
Zusammenstellung der verwendeten Chemikalien findet sich in Tab. 13 im Anhang.
Normalsalzlösung (NSL) ist eine modifizierte Ringerlösung für Egelpräparate (Lohr 1998, vgl.
Nicholls Baylor 1968). Außer zur Aufbewahrung von Ganglien wurde sie auch als Spüllösung
während der Präparation verwendet. Die Lösung wurde im Kühlschrank gelagert und wöchentlich
neu angesetzt.
10
Tabelle 2: Zusammensetzung der verwendeten Aufbewahrungsmedien.
Konzentrationen in mmol/l, Osmolarität in mosm/l
Parameter
NSL
NSL+
Glucose
Pyruvat-
BEL
Malat-
BEL
[Na
+
]
89
89
89
89
[K
+
]
4
4
4
4
[Ca
2+
]
2
2
2
2
[Mg
2+
]
1
1
1
1
[Cl
-
]
95
95
90
65
[HEPES]
10
10
10
10
[Glucose]
10
[Pyruvat]
5
[Malat]
15
Osmolarität
186
187
186
171
pH
7,4
7,4
7,4
7,4
Zum Ansetzen von Normalsalzlösung mit Glucose (Glucose-NSL) wurden 0,49 g Glucose-
Monohydrat eingewogen, in 250 ml NSL aufgelöst und die Lösung anschließend mittels eines
Spritzenfilters mit 0,22 µm Porendurchmesser sterilfiltriert. Die Lösung wurde im Kühlschrank
gelagert und alle drei Tage neu angesetzt.
Tabelle 3: Substanzen in den Aufbewahrungsmedien
Konzentrationen in mmol/l
Substanz
NSL
Glucose-
NSL
Pyruvat-
BEL
Malat-
BEL
[NaCl]
85
85
80
55
[KCl]
4
4
4
4
[CaCl
2
]
2
2
2
2
[MgCl
2
]
1
1
1
1
[HEPES]
10
10
10
10
[Glucose]
10
[Na-Pyruvat]
5
[Na
2
-Malat]
15
Bei den verwendeten Blutersatzlösungen (BEL) wurden die Konzentrationen an Kationen und
HEPES der NSL beibehalten, Cl
-
wurde anteilsmäßig durch organische Säurereste ersetzt.
5 mM Pyruvat-Blutersatzlösung (Pyruvat-BEL) lehnt sich an den Pyruvat-Anteil von Leibovitz-
Medium an. Die Lösung enthält 5 mM Pyruvat, womit der Cl
-
-Gehalt im Vergleich zu NSL um 5
mM reduziert war. Die Lösung wurde im Kühlschrank gelagert und wöchentlich neu angesetzt.
11
15 mM Malat-Blutersatzlösung (Malat-BEL) lehnt sich an die Analysen des Blutegel-Bluts von
Zebe et al. (1981) und Hildebrandt Zerbst-Boroffka (1992) an. Die Lösung enthält 15 mM Malat.
Da Malat ein zweiwertiges Anion ist, war der Cl
-
-Gehalt im Vergleich zu NSL um 30 mM reduziert.
Die Lösung wurde im Kühlschrank gelagert und wöchentlich neu angesetzt.
2.4 Testlösungen
Für die elektrophysiologischen Versuche wurden Testlösungen mit erhöhter K
+
-Konzentration,
Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) und Kainat angesetzt. Eine vollständige Zusammenstellung
der verwendeten Chemikalien findet sich in Tab. 13 im Anhang.
40 mM K
+
-Testlösungen wurden analog zu den Aufbewahrungsmedien in 2.3 angesetzt, wobei
jeweils 36 mM NaCl durch 36 mM KCl ersetzt wurden. Der pH-Wert wurde statt mit NaOH mit
1 M KOH eingestellt. Die Lösungen wurden im Kühlschrank gelagert und wöchentlich neu
angesetzt
Zum Ansetzen von Serotonin-Testlösung wurde 1 mM Serotonin-Kreatinin-Sulfat-Komplex in das
entsprechende Aufbewahrungsmedium eingewogen. Die Lösungen wurden im Kühlschrank
gelagert und alle 3 Tage neu angesetzt.
Zum Ansetzen von Kainat-Testlösungen mit 1, 3, 10, und 30 µM wurde die entsprechenden Menge
an 25 mM Kainsäure-Stammlösung zum jeweiligen Aufbewahrungsmedium pipettiert. Die
Lösungen wurden im Kühlschrank gelagert und wöchentlich neu angesetzt
2.5 Mikroelektroden
Verwendet wurden elektrolytgefüllte Einzelkanal-Glasmikroelektroden. Zur Herstellung der
Elektroden wurden Borosilikatglas-Kapillaren (Ø außen 1,5 mm, Ø innen 0,86 mm, Länge 7,5 cm)
mit einem Vertikalpullers scharf ausgezogen. Diese Rohelektroden wurden mittels einer
Einmalspritze mit 23-Gauge-Kanüle luftblasenfrei mit Elektrolyt befüllt (0,5 M K
2
SO
4
/ 20 mM
KCl in wässriger Lösung). In den Elektrodenschaft wurde ein chlorierter Silberdraht (Ø 0,5 mm) so
tief eingeführt, dass sich das Vorderende des Drahtes ~ 1 mm vor Beginn der Verjüngung befand.
Die Elektroden wurden am Hinterende mit Hart-Klebewachs luftdicht versiegelt. Der
Elektrodenwiderstand betrug ~ 60 M.
Eine Zusammenstellung von Material Geräten findet sich in den Tab. 13 und Tab. 14 im Anhang.
12
2.6 Baderdung
Das Versuchsbad wurde über eine Agarbrücke geerdet. Zur Herstellung der Brücke wurden
Plastikschlauchstücke (Ø außen 3 mm, Ø innen 2 mm, Länge 4 cm) blasenfrei mit 3 % Agar in
3 mM KCl-Lösung befüllt, ein chlorierter Silberdraht bis ~ 8 mm vor Schlauchende eingeschoben
und die Elektroden am Hinterende mit Hart-Klebewachs luftdicht verschlossen.
2.7 Messapparatur und Versuchsaufbau für die Elektrophysiologie
Die isolierten Segmentalganglien wurden in einer Versuchskammer fixiert. Dazu wurde der Boden
einer Durchflusskammer aus Plexiglas mit Zweikomponenten-Silikonkautschuk ausgegossen und
die an den Ganglien belassenen Konnektive und Seitenwurzeln mit Minutien (feinen
Insektennadeln) unter leichtem Zug darin festgesteckt. Die Zufuhr der Superfusionslösungen
erfolgte nach dem Prinzip eines Saughebers, wobei die Schläuche (Ø innen 1 mm) durch eine mit
Klemmen versehene Mischbatterie geführt wurden, um die Lösung schnell wechseln zu können.
Abgesaugt wurde die Lösung aus der Kammer durch eine mit einer Rollenpumpe verbundene
Kapillare. Das Kammervolumen betrug ~ 0,13 ml und die Superfusionsgeschwindigkeit betrug
~ 14 µl/s ; somit wurde die Lösung in der Kammer etwa alle 9 s ausgetauscht.
Die Badelektrode wurde durch eine Bohrung in die Versuchskammer geführt. Die Bohrung befand
sich gegenüber dem Lösungszufluss in der Nähe der Absaugkapillare, so dass ein Kontakt des
Präparats mit dem aus der Agarbrücke diffundierendem KCl ausgeschlossen war. Die
Mikroelektrode wurde im Halter eines mechanischen Mikromanipulators befestigt. Beide
Elektroden waren über Kupferkabel mit Krokodilklemmen an einen Messkopf angeschlossen, der
wiederum über ein niederohmiges Kabel mit einem Elektrodenverstärker verbunden war. Vom
Elektrodenverstärker ausgehend wurde das Signal auf einem Oszilloskop dargestellt und mittels
eines Papierschreibers analog registriert. Zugleich wurde das Signal mit einem Analog-Digital-
Wandler (Digitizer) digitalisiert und über einen seriellen Anschluss an einen PC übertragen, wo es
mit einem Datenregistrierungsprogramm mit einer Aufnahmefrequenz von 5 kHz aufgezeichnet
wurde.
Die Versuche wurden zur optischen Kontrolle unter einem Stereomikroskop mit 17,5- bis 112,5-
facher Vergrößerung durchgeführt. Zu diesem Zweck war es möglich, die Kammer von unten her zu
beleuchten.
Zur Reduktion von Rauschen und Störungen befanden sich Messkammer, Absauger,
Mikromanipulator, Elektroden und Messkopf des Elektrodenverstärkers auf einer
13
schwingungsgedämpften Stahlplatte, die auf pneumatischen Stoßdämpfern gelagert war. Dieser Teil
des Versuchsaufbaus war innerhalb eines Faraday'schen Käfigs aus Stahlblech untergebracht. Die
einzelnen Komponenten (mit Ausnahme der Mikroelektrode) waren elektrisch leitend miteinander
verbunden und über den Erdungsanschluss des Oszilloskops geerdet.
Eine Liste der verwendeten Geräte mit Hersteller- Typenbezeichnung findet sich in Tab. 14 im
Anhang.
Die untersuchten Zellen wurden anhand ihrer Lage und ihres elektrophysiologischen Verhaltens
identifiziert. Nach dem Einstich der Elektrode wurde eine Weile gewartet, bis das gemessene
Membranpotential über einen Zeitraum von mindestens 1 min im Bereich von ± 1 mV stabil blieb.
Diese Einheilzeit betrug zwischen 2 und 30 min, im Regelfall etwa 10 min (siehe Abb. 10, 13, 16).
Nach dem Einheilen wurde der jeweilige Versuch durchgeführt. Nach Abschluss des Versuches und
Auszug der Elektrode aus der Zelle lief die Aufzeichnung für etwa 1 min nach, um eine eventuelle
Drift des Bezugspotentials feststellen zu können. Alle verwendeten Lösungen wurden in
Badkontrollen auf ihren Einfluss auf das Elektrodenpotential untersucht. Lediglich der Wechsel der
Superfusionslösung von NSL auf Malat-BEL führte zu einer Veränderung des Elektrodenpotentials
um ~ -4 mV. Dieser Effekt wurde bei der Datenauswertung berücksichtigt. Alle Versuche wurden
bei Raumtemperatur von 18 bis 25°C durchgeführt.
14
Abbildung 4: Versuchsaufbau Elektrophysiologie.
Vereinfachtes Schema der Messapparatur.
2.8 Elektrophysiologische Versuchsprotokolle
2.8.1 Ruhemembranpotential und Aktionspotentiale von Retzius- und Leydig-Neuronen
Ziel des Versuchs war, zu beobachten, inwiefern sich Ruhemembranpotential und die Generierung
von Aktionspotentialen durch Retzius- und Leydig-Neuronen im Verlauf mehrerer Tage in
verschiedenen Aufbewahrungsmedien verändern. Zu diesem Zweck wurden isolierte
Segmentalganglien mit ihrer jeweiligen Aufbewahrungsmedien umspült und das Membranpotential
der Neuronen nach Einheilen der Elektrode registriert. Der Versuch wurde an den folgenden Tagen
wiederholt, bis von den Zellen kein eindeutiges Signal mehr zu erhalten war.
2.8.2 Membranpotential von Neuropil-Gliazellen
Ziel des Versuchs war, zu beobachten, inwiefern sich Ruhemebranpotential der Neuropilgliazellen
bei mehrtägiger Lagerung in verschiedenen Aufbewahrungsmedien verändert. Dazu wurden
isolierte Segmentalganglien mit ihrer jeweiligen Aufbewahrungslösung umspült und das
Membranpotential der anterioren Neuropil-Gliazelle nach Einheilen der Elektrode registriert. Zum
Einstich in diese Zelle wurde die Elektrodenspitze zwischen den Retzius-Neuronen hindurch einige
dutzend µm tief in das Zentrum des Ganglions geführt. In Fällen, in denen es unklar war, ob sich
die Elektrodenspitze tatsächlich innerhalb der Neuropil-Gliazelle befand, wurde dies nach der
Messung durch Applikation von 40 mM K
+
überprüft.
2.8.3 Kurzfristige Effekte von Malat-Blutersatzlösung auf Neuronen
Ziel des Versuches war es, festzustellen, wie Neuronen auf eine kurz andauernde Applikation von
15 mM Malat-BEL reagieren. In NSL aufbewahrte Segmentalganglien wurden mit NSL umspült.
Nach Einheilen der Elektrode wurde das Ganglion für 30 s mit Malat-BEL superfundiert. Die
Lösung wurde anschließend mindestens 5 min mit NSL ausgewaschen. Danach wurde das Ganglion
erneut für 3 min mit Malat-BEL superfundiert und die Lösung für mindestens 10 min mit NSL
ausgewaschen. Die Versuche erfolgten am Präparationstag und wurden sowohl für Retzius-
Neuronen, als auch für Leydig-Neuronen durchgeführt.
2.8.4 Wirkung von erhöhter extrazelluläre K
+
-Konzentration auf Retzius-Neuronen
In diesem Versuch wurde die Reaktion von Retzius-Neuronen auf die Applikation einer Lösung mit
10-fach erhöhter K
+
-Konzentration getestet. Das Ruhemembranpotential einer Zelle kann durch die
Goldman-Hodgkin-Katz-Gleichung (GHK-Gleichung) beschrieben werden:
15
R: universelle Gaskonstante ; T: absolute Temperatur
F: Faraday-Konstante ; z: Ladungszahl
P: Permeabilitätskoeffizient
[Na
+
], [K
+
], [Cl
-
]: Konzentration von Na
+
, K
+
, Cl
-
Index
e
: extrazellulär ; Index
i
: intrazellulär ;
Im Ruhezustand ist der Permeabilitätskoeffizient für K
+
am höchsten, die Terme mit [K
+
]
e
und [K
+
]
i
sind im Verhältnis zu den anderen Gliedern groß. Das Membranpotential der Zelle liegt dicht am
K
+
-Gleichgewichtspotential und reagiert empfindlich auf Änderungen der extrazellulären K
+
-
Konzentration (Nicholls et al. 2002). Alle verwendeten Aufbewahrungsmedien enthielten 4 mM K
+
.
Dieser Versuch fand in zwei Varianten statt.
In der ersten Variante wurden in NSL aufbewahrtes Ganglien am Präparationstag für mindestens 3
min mit NSL superfundiert. Nach Einstich und Einheilen der Elektrode wurde die [K
+
]
e
für 30 s auf
40 mM erhöht. Anschließend wurde die Testlösung für mindesten 5 min mit NSL ausgewaschen
(Vorkontrolle). Dann wurde die Superfusionslösung auf Malat-BEL gewechselt. K
+
-Applikation und
Auswaschen wurden wiederholt (Hauptversuch). Dann wurde die Superfusionslösung auf NSL
zurückgewechselt, K
+
-Applikation und Auswaschen wurden erneut wiederholt (Nachkontrolle). Ziel
des Versuches in dieser Variante war es, herauszufinden, ob der Wechsel von NSL auf Malat-BEL
kurzfristig die Wirkung von erhöhter [K
+
]
e
verändert.
In der zweiten Variante wurden in den verschiedenen Aufbewahrungsmedien gelagerte Ganglien
mit ihrem jeweiligen Aufbewahrungsmedium umspült. Nach Einstich und Einheilen der Elektrode
wurde die [K
+
]
e
für 30 s auf 40 mM erhöht. Anschließend wurde die Testlösung für mindestens 5
min mit Aufbewahrungsmedium ausgewaschen. Um den Einfluss des Alters der Präparate auf die
Wirkung der erhöhten [K
+
]
e
zu bestimmen, wurde der Versuch in dieser Variante an Ganglien
verschiedenen Alters durchgeführt.
2.8.5 Wirkung von Serotonin auf Retzius-Neuronen
In diesem Versuch wurde die Reaktion der Retzius-Neuronen auf die Applikation von Serotonin
getestet. Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) ist ein biogenes Amin, das aus der Aminosäure
Tryptophan synthetisiert wird (Nicholls et al. 2002). Beim Blutegel ist es an der Modulation von
Schwimm- und Fressverhalten beteiligt (Lent 1985). In Retzius-Neuronen erhöht Serotonin die
Membranpermeabilität für Cl
-
-Ionen (Munsch Schlue 1993). Pharmakologische Erkenntnisse
legen nahe, das diese Wirkung primär durch metabotrope 5-HT
2
-Rezeptoren vermittelt wird (Lucht
16
E
m
=
RT
zF
ln
P
Na
[
Na
+
]
e
P
K
[
K
+
]
e
P
Cl
[
Cl
-
]
i
P
Na
[
Na
+
]
i
P
K
[
K
+
]
i
P
Cl
[
Cl
-
]
e
1998).
Nimmt die Membranpermeabilität für Cl
-
zu, so wächst in der GHK-Gleichung (siehe 2.8.4) die
Bedeutung der Terme mit [Cl
-
]
e
und [Cl
-
]
i
und das Membranpotential der Zelle strebt gegen das
Chlorid-Gleichgewichtspotential.
Dieser Versuch fand in zwei Varianten statt.
In der ersten Variante wurde ein in NSL aufbewahrtes Ganglion am Präparationstag für mindestens
5 min mit NSL superfundiert. Nach Einstich und Einheilen der Elektrode wurde für 3 min eine
Lösung mit 1 mM 5-HT appliziert und anschließend für mindestens 5 min mit NSL ausgewaschen
(Vorkontrolle). Anschließend wurde die Superfusionslösung auf Malat-BEL gewechselt und die
5-HT-Applikation und das Auswaschen wiederholt (Hauptversuch). Dann wurde die
Superfusionslösung auf NSL zurückgewechselt und 5-HT-Applikation und Auswaschen wurden
erneut wiederholt (Nachkontrolle). Ziel des Versuches in dieser Variante war es, herauszufinden, ob
der Wechsel von NSL auf Malat-BEL kurzfristig die Wirkung von 5-HT verändert.
In der zweiten Variante wurden in den verschiedenen Aufbewahrungsmedien gelagerte
Segmentalganglien mit ihrem jeweiligen Aufbewahrungsmedium umspült. Nach Einstich und
Einheilen der Elektrode wurde für 3 min 1 mM 5-HT appliziert und anschließend für mindesten
5 min mit Aufbewahrungsmedium ausgewaschen. Um den Einfluss des Alters der Präparate auf die
Wirkung der 5 -HT-Applikation zu bestimmen, wurde der Versuch in dieser Variante an Ganglien
verschiedenen Alters durchgeführt. Ferner sollten mittels der Ergebnisse Rückschlüsse auf das Cl
-
-
Gleichgewichtspotential (E
Cl
) der Retzius-Zellen in den vier Aufbewahrungslösungen ermöglicht
werden.
2.8.6 Wirkung von Kainat auf Retzius-Neuronen
Ziel des Versuchen war es, die Reaktion der Retzius-Neurone auf die Applikation von Kainat zu
untersuchen. Kainat, das Anion der Kainsäure, ist ein Strukturanalogon des Glutamats. Es wirkt als
spezifischer Agonist des nach ihm benannten Subtyps ionotroper Glutamatrezeptoren. Kainat übt
sowohl prä- als auch postsynaptische Effekte aus und wirkt in höheren Konzentrationen mitunter
exzitotoxisch (Huettner 2003). Der Kainatrezeptoren sind ligandenaktivierte Kationenkanäle, die
für Na
+
und K
+
permeabel sind (Nicholls et al. 2002).
Dieser Versuch fand in zwei Varianten statt.
In der ersten Variante wurde ein in NSL aufbewahrtes Ganglion am Präparationstag für mindestens
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Details
- Seiten
- Erscheinungsform
- Erstausgabe
- Erscheinungsjahr
- 2011
- ISBN (PDF)
- 9783958206380
- ISBN (Paperback)
- 9783958201385
- Dateigröße
- 5.9 MB
- Sprache
- Deutsch
- Institution / Hochschule
- Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
- Erscheinungsdatum
- 2015 (Februar)
- Note
- 2
- Schlagworte
- Hirudo Elektrophysiologie Malat Citratzyklus Neurobiologie
- Produktsicherheit
- BACHELOR + MASTER Publishing
